越來越多的調(diào)查顯示，心血管疾病、癌癥、 糖尿病以及阿爾茲海默癥患者在逐年增加，而 引起這些疾病的主要原因是氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧 化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用的平衡被破壞， 從而產(chǎn)生過多的自由基，這被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和 疾病的一個重要影響因素。因此，抗氧化劑的研 究成為了近年來的熱點方向。抗氧化肽是天然抗 氧化劑的一種，有著良好的抗氧化性，可以有效 清除體內(nèi)多余的自由基，從而降低衰老和患病的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

植物乳桿菌(L. plantarum， LP)L60：實驗室保藏；脫脂羊乳粉：富平縣秦源 乳業(yè)有限公司。 MRS肉湯培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉 4.0、磷酸氫二鉀2.0、乙酸鈉5.0、硫酸錳0.04、 牛肉膏8.0、葡萄糖20.0、檸檬酸氫二銨2.0、硫 酸鎂0.2、吐溫80 1.0，pH5.7±0.2，121 ℃滅菌15 min。 復(fù)原羊乳培養(yǎng)基：將脫脂羊乳粉與蒸餾水混 合配制成濃度為14%的復(fù)原羊乳，90 ℃滅菌15 min。 發(fā)酵培養(yǎng)基：復(fù)原羊乳14%，氯化鈉1.02%、 蛋白胨0.82%、葡萄糖0.72%，于90 ℃巴氏滅菌15 min。

1.1.2 主要試劑與儀器

氯化鈉：天津市富宇精細 化工有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有 限責(zé)任公司；葡萄糖：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑 廠；Hip-His-Leu(HHL)、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋 白酶：美國Sigma公司；Alcalase：丹麥諾維信 公司。 JA6001電子分析天平：北京賽多利斯天平有 限公司；YX-280D手提式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰 濱江醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F單人雙面超凈無菌操 作臺：蘇州江東精密儀器有限公司；DH5000AB 電熱恒溫培養(yǎng)箱、DK-98-1電熱恒溫水浴鍋、 WG-71電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限 公司；BCD-254博西華冰箱：博西華家用電器有 限公司；UV-5300PC紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；Q2-901漩渦混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；OPTEC生物顯微鏡：重 慶奧特光學(xué)儀器有限公司；GT10-1臺式高速離心 機：北京時代北利離心機有限公司；PHS-3C酸度 計：上海精科儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將L60凍干菌粉接種于滅菌MRS 肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化3代， 得到3代菌懸液。將3代菌懸液以5%的接種量接入 濃度為14%的復(fù)原羊乳培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)至 凝乳，重復(fù)2次后保存于冰箱備用。 1.2.2 發(fā)酵羊乳制備 將蛋白酶按0.15%的添加量 加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 min后將活化后的L60接 種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，41 ℃恒溫培養(yǎng)至凝乳，置于 4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 待測乳清樣品制備

取一定量發(fā)酵羊乳于 100 mL燒杯中，測定其pH值。用濃度為1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵乳pH至3.4～3.6，8000 r/min離 心15 min并取其上清液；再用1 mol/L NaOH溶液 調(diào)節(jié)發(fā)酵乳pH至8.3，8000 r/min離心15 min，收集 上清液作為待測樣品。

1.2.4 OD值的測定

取1 mL發(fā)酵乳于50 mL燒杯 中，加入9 mL EDTA(0.2%)溶液，調(diào)節(jié)pH至12左 右，混勻，靜止5 min，以滅菌乳作為空白調(diào)零， 在640 nm波長下測定吸光度值。

1.2.5 pH值的測定

測量前對PHS-3C酸度計進行 標(biāo)定，然后取一定量發(fā)酵乳于100 mL燒杯中，使 用酸度計進行測定。

1.2.6 酸度的測定

使用氫氧化鈉滴定法，酸 度值用吉爾涅爾度(°T)表示。取5 mL發(fā)酵乳加入 到100 mL錐形瓶中，然后加入10 mL蒸餾水，并 滴加2～3滴酒精酚酞指示劑，混勻。用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，不斷搖動，當(dāng)溶液中產(chǎn) 生微紅色并且在30 s內(nèi)不變色時，結(jié)束滴定。記錄 消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)(V)，乘以20即得 到100 mL發(fā)酵液的滴定酸度。

1.2.7 肽含量的測定

利用課題組前期繪制的肽標(biāo) 準(zhǔn)曲線進行測定。 取2.5 mL待測乳清樣液，加入2.5 mL 10%(w/ v)的TCA水溶液，混勻，靜置10 min，4000 r/min 離心15 min。收集上清液置于50 mL容量瓶中，以 5%的TCA溶液定容，然后取6.0 mL上述溶液于燒 杯中，加入4.0 mL雙縮脈充分混合，靜置10 min，2000 r/min離心10 min。收集上清液于540 nm下測 定吸光度，代入關(guān)系式，計算出肽濃度。

1.2.8 DPPH自由基清除率測定

將DPPH溶于95% 無水乙醇，配制0.l mmol/L DPPH自由基溶液。 將2 mL待測乳清樣品與8 mL DPPH自由基溶液混 勻作為試驗組，2 mL乙醇溶液與8 mL DPPH自由 基溶液混勻作為對照組，2 mL待測乳清樣品與 8 mL乙醇溶液混勻作為空白組。

2 結(jié)果與討論

將單一蛋白酶(木瓜蛋白酶、Alcalase、風(fēng)味 蛋白酶)和復(fù)合蛋白酶(Alcalase和木瓜蛋白酶， Alcalase和風(fēng)味蛋白酶，Alcalase、風(fēng)味蛋白酶和 木瓜蛋白酶)分別按0.15%的添加量(復(fù)合酶等比例 添加)加入到于90 ℃滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，酶解 30 min，然后按5%接種量接入L60，于41 ℃下開 始發(fā)酵，分別測定發(fā)酵0、4、8、12 h的pH值和滴 定酸度。將單一蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分別按0.15%的添 加量添加到滅菌后的羊乳中，酶解30 min，然后 接入L60發(fā)酵，每隔4 h取樣測定其DPPH自由基清 除率，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，DPPH自 由基清除率并沒有表現(xiàn)出一定的規(guī)律性，4 h處添 加蛋白酶的發(fā)酵羊乳DPPH自由基清除率已有超過 對照組的，最大組為P+A組，DPPH自由基清除率 為71.1%，此時對照組為48.69%，說明可以通過 添加蛋白酶來縮短生產(chǎn)抗氧化肽的時間。8 h處， 除去A組，其他各組的DPPH清除率都有下降，可 能是由于菌體內(nèi)的肽酶使抗氧化肽進一步水解。

3 結(jié)論

蛋白酶的添加，使發(fā)酵羊乳表現(xiàn)出了更高 的肽含量，這得益于蛋白酶較高的水解活性。 另外，添加蛋白酶顯著提高了植物乳桿菌L60發(fā) 酵羊乳的DPPH自由基清除率。DPPH自由基清 除率最大的是添加單一蛋白酶(木瓜蛋白酶)，為 75.29%，對照組為70.02%。以上結(jié)果表明，添加 蛋白酶提高發(fā)酵脫脂羊乳的DPPH自由基清除率是 可行的，這將有助于生產(chǎn)具有高抗氧化性的功能 性發(fā)酵羊乳飲料。