腦出血（ICH）是較為嚴重的一種急性腦血管疾 病，約占全部腦卒中的10%~17%。本病發病死亡率高，在北美，ICH患者發病30 d內的死亡率約為44%， 僅有20%的患者預后良好。ICH患者的神經功能損 傷一般較為嚴重，急性期多伴有頭痛、單側虛弱、嘔吐、 癲癇和意識障礙等癥狀，即便好轉之后常會遺留肢體 不遂，語言、感覺障礙等嚴重問題。血液破入腦實質或腦室，不僅直接損傷神經系統，而且出血所觸發的炎癥 信號會引起促炎癥細胞因子如細胞間黏附分子-1 （ICAM-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）的表達異常，從而 產生炎癥級聯反應，造成神經功能繼發性損傷。本實 驗采用自體血注射所制備的大鼠ICH模型，以針刺水 溝、內關為干預方法，觀察不同針刺施術時長下ICH急 性期大鼠腦血腫周圍區域ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL6、HSP70含量的變化規律，從炎癥反應與腦組織保護 角度，探究不同針刺量學條件下的作用機制。現報告 如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康的 SPF 級 8 周齡左右雄性 SD大鼠共40只，體質量（300±25）g。實驗大鼠由北京 維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產 許可證號：SCXK（京）2016-0002。于中國醫學科學院 放射醫學研究所飼養，實驗動物使用許可證：SYXK （津）2014-0002。環境溫度20~25 ℃，晝夜規律飼養。

1.2 試藥與儀器

小鼠單克隆抗體 ICAM-1（Abcam 公司，編號 171123）、小鼠單克隆抗體 TNF-α（Abcam 公司，編號 220210）、兔多克隆抗體 IL-1β（Abcam 公 司，編號9277）、小鼠單克隆抗體IL-6（Abcam公司，編 號9324）、小鼠單克隆抗體HSP-70（Abcam公司，編號 2787）；蘇木素、DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物 技術有限公司）；渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號其林貝爾QL-902）；恒溫水浴箱（江蘇太倉醫 用儀器廠，型號 DSHZ-300）；離心機（Eppendorf 公司， 型號5430）；石蠟切片機（萊卡公司，型號RM2015）；顯 微鏡（奧林巴斯公司，型號：BX51T-PHD-J11）；醫用X 射線膠片（柯達公司）；多功能真彩色細胞圖像分析管 理系統（Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus）；針灸 針（華佗牌，規格0.25 mm×40 mm）。

1.3 分組與造模

采用 SPSS19.0 軟件系統產生隨機 數法將48只大鼠隨機分為4組，假手術組、模型組、針 刺5 s組、針刺60 s組，每組10只。Sham組于術后次日 開始模擬針刺組的捉抓過程，每日1次；模型組于造模 成功后次日開始模擬針刺組的捉抓過程，每日1次；針 刺組于造模成功后次日開始針刺干預，每日1次。大 鼠在干預5 d后（假手術、造模后第6日）斷頭取腦，制 備石蠟切片和凍存樣品。本次實驗對實驗動物的處理 符合國際獸醫學編輯協會編纂的《關于動物倫理與福 利的作者指南共識》。采用尾狀核自體血注入法制作 ICH 模型。大鼠經 10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻 醉，劑量為300 mg/kg，麻醉后剃除頭頂毛；斷尾取血并 將血擠入抗凝管內，用微量注射器抽入微量注射器 （100 μL）中備用。俯臥位，固定其于大鼠腦立體定位儀，先固定耳間線，移頭部至正中，固定門齒于齒溝上， 調整腦定位儀，使門齒溝平面略低于耳間線平面；碘伏 溶液皮膚消毒后沿正中皮膚、肌肉剪開約1.5 cm縱向 切口，血管鉗分離，過氧化氫水溶液拭去顱骨骨膜，顯 露顱骨，暴露顱骨上的前囟和冠狀縫區域，此時大鼠尾 部正對實驗者，以前囟為原點，在向前旁開2 mm，向右 旁開 3 mm 處，用直徑 1 mm 骨鉆鉆孔，孔直徑約為 1 mm，以不損傷腦組織，鉆尖下落空感為度；將定位儀 上的微量注射器針尖移至要注射的部位，緩慢進針 5 mm，向尾狀核內緩慢（7 mins）注入50 μL自體全血， 留針 10 mins 后將注射針緩慢退出，并用骨蠟封閉鉆 孔，縫合皮膚、肌肉并用碘伏溶液消毒防止創口感染； 置于溫度適宜處自然蘇醒，此過程應保持大鼠自主呼 吸。麻醉蘇醒后，大鼠出現或不立即出現神經功能缺 損癥狀，歸籠飼養，次日出現明顯神經功能缺損癥狀， 認為造模成功。Sham組模擬皮膚、顱骨創傷過程但不 刺入腦組織。

1.4 針刺方法

兩針刺組均選取大鼠“水溝”穴、雙側 “內關”穴，大鼠腧穴定位根據中國針灸學會實驗針灸 研究會編寫的《動物針灸穴位圖譜》中的“水溝”“內關” 穴位置；水溝穴采用“雀啄”法，內關穴采用捻轉瀉法； 針刺5 s組各穴施快頻率（3次/s）手法5 s，針刺60 s組 各穴施快頻率（3 次/s）手法 60 s，刺畢不留針，每日 1 次，共5次。

1.5 標本采集與檢測

1）各組取5只大鼠麻醉，行4% 多聚甲醛內固定術，打開胸腔暴露心臟，在右心耳剪開 小口，經左心室插入導管至升主動脈，顯露導管；注射 200 mL 0.9%氯化鈉注射液沖洗血液至心耳處流出清 水，肝臟顏色變淺；再經150 mL 4%多聚甲醛灌注至肝 臟、四肢、尾部僵硬 。斷頭處死后，在冰板上迅速開顱 取腦，放置于4%多聚甲醛溶液中待測；每只取血腫區 及周圍腦組織約100 mg，制備免疫組化切片；
2）另取5 只大鼠，斷頭取腦，分離血腫區及周圍腦組織作蛋白質 印跡法（Western blotting）分析腦血腫區 HSP-70 蛋白 表達；免疫組化法檢測腦血腫區ICAM-1、TNF-α、IL1β、IL-6含量。

1.6 統計學處理

應用 SPSS19.0 統計軟件。計量資 料以（x±s）表示，樣本定量分析應用單因素方差分析， 方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時使用Dunnett′-T3 檢 驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

假手術組ICAM-1陽性細胞為生理性表 達；與假手術組比較，模型組、針刺5 s組、針刺60 s組 ICAM-1表達增強；與模型組比較，針刺5 s組ICAM-1 表達差異無統計學意義（P > 0.05）；針刺60 s組表達減少（P < 0.05）。假手術組IL-6陽性細胞為生理水平表達； 與假手術組相比，模型組、針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達增強；與模型組比較，針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達減少（P < 0.05），且針刺 60 s 組降低更明顯（P < 0.05）。

3 討 論

ICH在中醫理論中可歸于“中風”病范疇，中醫經 典中也以“大厥”“薄厥”“仆擊”“風痱”“偏枯”等名稱記述，病勢多較危急，本病病因正氣虧虛，情志、飲食、勞 倦內傷，病機為氣血逆亂，血溢腦脈之外，產生風、火、 痰、瘀等病理產物，以突然昏仆、口舌歪斜、半身不遂、 言語謇澀或失語等癥狀為主要臨床表現，有中經絡、中 臟腑之分。針刺是 ICH 急性期臨床上廣泛應用的療 法，其中研究較多的具體方法主要有醒腦開竅針法與 頭皮針透刺法，本實驗以醒腦開竅法為基礎，以醒腦開 竅主穴“水溝”“內關”穴為干預腧穴，探究在不同手法 作用時長下的大鼠腦組織炎癥反應因子的含量變化。



 

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